9ª PRÁCTICA

29/01/2020
PRÁCTICA Nº9: "DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE COLESTEROL HDL"

OBJETIVO

• Determinar la concentración de HDL colesterol en la muestra del paciente mediante la medición de absorbancias por espectrofotometría.

UTILIDAD CLÍNICA
Las partículas de HDL son lipoproteínas de alta densidad que transportan el colesterol desde los tejidos del cuerpo hasta el hígado. Debido a que las HDL pueden retirar el colesterol de las arterias y transportarlo de vuelta al hígado para su excreción, se les conoce como el colesterol o "lipoproteína buena", ya que niveles elevados están relacionados con un menor riesgo cardiovascular.
Un nivel bajo de colesterol HDL es considerado uno de los principales factores de riesgo cardiovascular y enfermedades de las arterias coronarias.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

FUNDAMENTO
Determinación directa del HDLc (colesterol de lipoproteínas de alta densidad) sin necesidad de pre-tratamiento o centrifugado de la muestra.
La determinación se realiza en dos pasos:

- 1º Eliminación de lipoproteínas no-HDL.
Ésteres colesterol ------> Colesterol + Ácidos grasos
                             CHE
Colesterol + O2 --------> Colestenona + H2O2
                          CHOD
2 H2O2 ----------> 2 H2O + O2
             Catalasa

-2º Medición de HDLc.
Ésteres colesterol ------> Colesterol + Ácidos grasos
                             CHE
Colesterol + O2 -------> Colestenona + H2O2
                          CHOD
2 H2O2 + HDAOS + 4-AA -------> Pigmento Quinona + 4 H2O
                                              POD
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de HDLc presente en la muestra ensayada.

APARATAJE

• Espectrofotómetro.
• Baño María.

MATERIALES

• Gradilla.
• 6 tubos de ensayo de 3 mL.
• Rotulador permanente.
• Pipetas automáticas de 10-100 microlitros, 100-1000 microlitros y 1-10 microlitros.
• Puntas azules y amarillas y de 10 microlitros.
  
• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Tapones azules para los tubos de ensayo.
• Cubetas de espectrofotometría.
• Papel para limpiar las paredes de las cubetas antes de medir la absorbancia de cada sustancia en el espectrofotómetro.
  

REACTIVOS

• R1: [N,N-bis (2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfonico ácido pH 6,6 (100 mM), N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5- dimetoxianilina (HDAOS) (0'7 mM), Colesterol esterasa (mayor o igual a 800 U/l), Colesterol oxidasa (mayor o igual a 500 U/L), Catalasa (mayor o igual a 300 U/L), y Ascórbico oxidasa (mayor o igual a 3000 U/L)].
• R2: [N,N-bis (2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfonico ácido pH 7,0 (1,1 mmol/L), 4-Aminoantipirina (4-AA) (100 mM) y Peroxidasa (mayor o igual a 3500 U/L)].
• HDLc/LDLc CAL: Calibrador. Suero humano liofilizado.

PRECAUCIONES
HDLc/LDLc CAL: Los componentes de origen humano han resultado ser negativos para el antígeno HBs, HCV y para el anti-HIV (1/2). Sin embargo, deben tratarse con precaución como potencialmente infecciosos.

MUESTRA

• Suero.

PROCEDIMIENTO
Antes de proceder a la realización de la práctica, debemos preparar el HDLc/LDLc CAL. Para ello, reconstituir el contenido de un vial con 1 mL de agua destilada. Tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.

1. Encender el espectrofotómetro y ajustarlo a las condiciones requeridas por la práctica.
2. Rotular 6 tubos de ensayo de 3 mL [(1 tubo para el Blanco, 1 para el Calibrador y 4 tubos de ensayo para las Muestras (1 muestra por persona)]. Pipetear:
1. 300 microlitros del R1 en cada uno de los 6 tubos de ensayo.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
2. 3 microlitros del HDLc/LDLc CAL en el tubo de ensayo rotulado como "Patrón".
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
3. 3 microlitros de suero del paciente en el tubo rotulado como "Muestra"(en cada uno de los 4 tubos).
   
   
   
   
   
   Nota: cambiar las puntas de pipeta cada vez que pipeteemos un reactivo diferente.

 3. Tapar los tubos de ensayo con tapones, mezclar por inversión e incubar 5 minutos a 37ºC en el baño María. Leer la absorbancia (A1) del calibrador y la muestra a 578 nm.

4. Añadir 100 microlitros del R2 en cada uno de los 6 tubos.

5. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC y leer la absorbancia (A2) a 578 nm frente al Blanco de reactivo.

CÁLCULOS
[(A2-A1) Muestra/ (A2-A1) Calibrador x Conc. Calibrador = mg/dL de HDL colesterol en la muestra.

RESULTADOS
- Absorbancia 1 de Muestra: 0'285 A.
- Absorbancia 1 del Calibrador: 0'036 A.

- Absorbancia 2 de la Muestra: 0'791 A.
- Absorbancia 2 del Calibrador: 0'280 A.
(0'791 - 0'285) / (0'280 - 0'036) x 33'2 = 68'85 mg/dL de HDL colesterol en la muestra.
El resultado nos indica que el paciente tiene un riesgo bajo de HDL Colesterol.

VALORES DE REFERENCIA
- Hombres: Riesgo menor (mayor de 50 mg/dL), riesgo normal (35-50 mg/dL) y riesgo elevado (menor de 35 mg/dL).
- Mujeres: Riesgo menor (mayor de 60 mg/dL), riesgo normal (45-60 mg/dL) y riesgo elevado (menor de 45 mg/dL).

INTERFERENCIAS
No se han observado interferencias con Bilirrubina hasta 30 mg/dL, hemoglobina hasta 500 mg/dL factores reumatoides hasta 1000 UI/mL o lipemia hasta 1200 mg/dL.
Muestras lipémicas con concentración de triglicéridos mayor a 1200 mg/dL, se deben diluir 1/10 con NaCl 9 g/L y multiplicar el resultado final por 10.

OBSERVACIONES

• El reactivo 2 presenta coloración amarillenta debido a la peroxidasa que contiene, lo cual no afecta en absoluto la funcionalidad del reactivo.
• R1 y R2 una vez abiertos, son estables 4 semanas a 2-8ºC.
• HDLc/LDLc CAL: Una vez reconstituido es estable 30 horas a 20-25ºC, 2 semanas a 2-8ºC o 3 meses a -20ºC.
• Estabilidad de la muestra: 6 días a 2-8ºC y 1 año conservada a -70ºC.
• Cambiar la punta de pipeta cada vez que sea preciso para evitar alterar los resultados, y por tanto, la aparición de falsos positivos.