8ª PRÁCTICA

23/01/2020
PRÁCTICA Nº8: "DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ÁCIDO ÚRICO"

OBJETIVO

• Determinar la concentración de ácido úrico presente en la muestra del paciente mediante la medida de absorbancias por espectrofotometría.

UTILIDAD CLÍNICA
El ácido úrico y sus sales son el producto final del metabolismo de las purinas. En una insuficiencia renal progresiva hay una retención en sangre de urea, creatinina y ácido úrico.
Niveles altos de ácido úrico son indicativos de patología renal y generalmente se asocia con la gota.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

FUNDAMENTO
El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoina y peróxido de hidrógeno (2 H2O2) que en presencia de peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF) y 2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS) forma un compuesto rosáceo:
Ácido úrico + 2 H2O + O2 ----------> Alantoina + CO2 + 2 H2O2
                                            Uricasa
2 H2O2 + 4-AF + DCPS -----> Quinonaimina + 4 H2O
                                        POD
La intensidad de quinonaimina roja formada es proporcional a la concentración de ácido úrico presente en la muestra ensayada.

APARATAJE

• Espectrofotómetro.
• Baño María.

MATERIALES

• Gradilla.
• 6 tubos de ensayo de 3 mL: Blanco, Patrón y 1 Muestra para cada uno (4 integrantes en el grupo, incluída yo).
• Rotulador permanente.
• Pipetas automáticas de 20-200 microlitros y de 100-1000 microlitros.
• Puntas de pipeta azules y amarillas.
• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Tapones para tubos de ensayo (azules).
• Cubetas de espectrofotometría.
• Papel para limpiar las paredes de la cubeta que se vaya a medir en el espectrofotómetro.
  

REACTIVOS

• R1: Tampón [Fosfatos pH 7,4 (50 mmol/L) y 2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS) (4 mmol/L)].
• R2: Enzimas [Uricasa (60 U/L), Peroxidasa (POD) (660 U/L), Ascorbato oxidasa (200 U/L) y 4-Aminofenazona (4-AF) (1 mmol/L)].
• URIC ACID CAL: Patrón primario acuoso de Ácido úrico (6 mg/dL).

MUESTRA
Se pueden utilizar como muestras: suero/plasma u orina de 24 horas. En el caso de mi grupo de compañeros, la muestra ha sido suero, concretamente de un niño.

PROCEDIMIENTO
Antes de realizar con el proceso de esta práctica, debemos preparar el reactivo de trabajo (RT). Para ello, disolver el contenido de un vial de R2 Enzimas en un frasco de R1 Tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.

1. Encender el espectrofotómetro y ajustarlo a las medidas requeridas por la práctica.
2. Rotular 6 tubos de ensayo de 3 mL como "Blanco", "Patrón" y "Muestra" (1 tubo para cada uno de ésta última). Posteriormente, pipetear:
1. 1 mL (=1000 microlitros) de reactivo de trabajo (RT) en cada uno de los 6 tubos de ensayo. Desechar la punta de pipeta en el bote de orina.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
2. 25 microlitros de URIC ACID CAL en el tubo rotulado como "Patrón". Desechar punta. 
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
3. 25 microlitros de suero del paciente en los 4 tubos rotulados como "Muestra". Desechar punta de pipeta.
   
   
   
   
   
   
   

3. Tapar los tubos con los tapones para éstos, mezclarlos e incubarlos 5 minutos a 37ºC en el baño María.

4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frente al blanco de reactivo. La longitud de onda a la que debemos medir en el espectrofotómetro es de 505 nm. El color es estable como mínimo 30 minutos.

CÁLCULOS
[(A) Muestra/ (A) Patrón ] x 6 = mg/dL de ácido úrico en la muestra.

RESULTADOS
- Absorbancia Patrón: 0'203 A.

- Absorbancia Muestra: 0'188 A.

(0'188/0'203) x 6 = 5'56 mg/dL de ácido úrico en la muestra.
El resultado de la práctica ha sido correcto, ya que la concentración se encuentra dentro del rango de los valores normales de ácido úrico.

VALORES DE REFERENCIA
- Mujeres: 2,5 - 6,8 mg/dL.
- Hombres: 3,6 - 7,7 mg/dL, como es el caso de esta práctica.

INTERFERENCIAS
No se han observado interferencias con bilirrubina hasta 170 micromol/L, hemoglobina hasta 130 mg/dL y ácido ascórbico hasta 570 micromol/L.

OBSERVACIONES

• Limpiar las paredes de las cubetas de espectrofotometría antes de medir una muestra en el espectrofotómetro.
• Respetar los tiempos para unos resultados correctos.
• El reactivo de trabajo es estable 1 mes en nevera (2-8ºC) o 10 días a temperatura ambiente.
• Estabilidad suero o plasma: 3-5 días a 2-8ºC y 6 meses a -20ºC.
• Estabilidad de orina 24 horas: 3 días a temperatura ambiente a pH > 8.
• En caso de utilizar orina de 24 horas como muestra, debemos diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por 50 (factor de dilución). Si la muestra es turbia, calentarla a 60ºC 10 minutos para disolver los precipitados de urato y ácido úrico. No refrigerar.