12ª PRÁCTICA

06/02/2020
PRÁCTICA Nº12: "BILIRRUBINA TOTAL"

OBJETIVO

• Determinar la concentración de bilirrubina total presente en la muestra del paciente por el método DMSO.Colorimétrico y mediante espectrofotometría.

UTILIDAD CLÍNICA
La bilirrubina se origina por la degradación de la hemoglobina.
Es transportada del bazo al hígado y se excreta en la bilis.
La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas más probables de la hiperbilirrubinemia:
- Bilirrubina Total: Aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas.
- Bilirrubina Directa: Colestasis hepática, alteraciones genéticas y alteraciones hepáticas.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

FUNDAMENTO
La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfanílico diazotado midiéndose fotométricamente. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucurónido y bilirrubina libre ligada a la albúmina, solo la primera reacciona en medio acuoso (bilirrubina directa) precisando la segunda la solubilización con dimetilsulfóxido (DMSO) para que reaccione (bilirrubina indirecta). En la determinación de la bilirrubina indirecta se determina también la directa, correspondiendo el resultado a la bilirrubina total.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de bilirrubina presente en la muestra ensayada.

APARATAJE

• Espectrofotómetro.

MATERIALES

• Gradilla.
• 6 tubos de ensayo de 3 mL.
• Rotulador permanente.
• Pipetas automáticas de 50 microlitros y de 100-1000 microlitros.
• Puntas de pipeta azules y amarillas.
• Tapones azules para los tubos de ensayo.
• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Cubetas de espectrofotometría.
• Papel para limpiar las paredes de las cubetas de espectrofotometría antes de realizar la medición de cada absorbancia.

REACTIVOS

• R1: Ácido sulfanílico (30 mmol/L), Ácido clorhídrico (HCl) (50 mmol/L) y Dimetilsulfóxido (DMSO) (7 mol/L).
• R2: Sodio nitrito (29 mmol/L).

MUESTRA

• Suero problema.

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar, encender el espectrofotómetro.
   Nota: Aunque como hoy hemos hecho 2 prácticas seguidas, ya estaba encendido.
2. Rotular 6 tubos de 3 mL: uno como "Blanco", otro como "Patrón" y los cuatro restantes con las iniciales de nuestros nombres (muestras de cada uno).
3. Pipetear:
1. 1,5 mL del reactivo 1 en todos los tubos.
   
   
   
   
   
   
   
2. 50 microlitros del reactivo 2 en el tubo "Patrón" y en los tubos de las muestras.
   
3. 100 microlitros de suero del paciente en todos los tubos y además, al tubo "Patrón" 100 microlitros del Calibrador, ya que se trata del suero control.
   
   
   
   
   
   
   

4. Mezclar e incubar a temperatura ambiente 5 minutos (15-25ºC).

5. Leer la absorbancia en el espectrofotómetro a 578 nm del: 1) Blanco, 2) Patrón y 3) Muestras.

 

CÁLCULOS
(A) Muestra / (A) Calibrador x Conc. Calibrador = mg/dL de bilirrubina.

RESULTADOS
- Absorbancia del Patrón: 0'278 A.
- Absorbancia de la Muestra: 0'285 A.
(0'285 / 0'278) x 1'17 = 1'2 mg/dL de bilirrubina.
El resultado ha salido un poco más elevado de los valores normales, ya sea por el tiempo transcurrido desde la medición de mi muestra (la última en medir de mis compañeros) o porque el paciente tenga riesgo leve de hiperbilirrubinemia por aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas.

VALORES DE REFERENCIA
Bilirrubina Total hasta 1,10 mg/dL.

INTERFERENCIAS
La presencia de hemólisis disminuye el valor de bilirrubina.
Se han descrito varias drogas y substancias que interfieren con la determinación del bilirrubina.

OBSERVACIONES

• Cambiar la punta de pipeta cada vez que sea necesario para evitar falsos positivos.
• Para la determinación de bilirrubina en neonatos, pipetear 50 microlitros de muestra. Multiplicar el resultado obtenido por 2.
• El reactivo 1 puede ser corrosivo para los metales. Provoca quemaduras graves en la piel y lesiones oculares graves. Contiene ácido sulfanílico. Puede provocar una reacción alérgica.
• El desarrollo de color en el R2 es un indicio de deterioro del reactivo.