7ª PRÁCTICA

08/01/2020
PRÁCTICA Nº7: "DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE TRIGLICÉRIDOS"

OBJETIVO

• Determinar la concentración de triglicéridos contenidos en la muestra del paciente mediante espectrofotometría.

UTILIDAD CLÍNICA
Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula.
Al igual que el colesterol, son transportados a las células del organismo por las lipoproteínas en la sangre.
Una dieta alta en grasas saturadas o carbohidratos puede elevar los niveles de triglicéridos.
Su aumento es relativamente inespecífico. Diversas dolencias, como ciertas disfunciones hepáticas (cirrosis, hepatitis, obstrucción biliar) o diabetes mellitus, pueden estar asociadas con su elevación.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

FUNDAMENTO
Los triglicéridos incubados con lipoproteinlipasa (LPL) liberan glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol es foforilado por glicerolfosfato deshidrogenasa (GPO) y ATP en presencia de glicerol quinasa (GK) para producir glicerol-3-fosfato (G3P) y adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es entonces convertido a dihidroxiacetona fosfato (DAP) y peróxido de hidrógeno (H2O2) por GPO.
Al final, el peróxido de hidrógeno (H2O2) reacciona con 4-aminofenazona (4-AF) y p-clorofenol, reacción catalizada por la peroxidasa (POD) dando una coloración roja:

Triglicéridos + H2O -----> Glicerol + Ácidos grasos libres
                                  LPL
Glicerol + ATP -------------------> G3P + ADP
                         Glicerolquinasa
G3P + O2 -----> DAP + H2O2
                GPO
H2O2 + 4-AF + p-Clorofenol -----> Quinona + H2O
                                               POD
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la muestra ensayada.

APARATAJE

• Espectrofotómetro.
• Baño María.

MATERIALES

• Tubos de ensayo.
• Rotulador permanente.
• Gradilla.
• Pipeta automática de 10-100 microlitros y puntas amarillas.
• Pipeta automática de 100-1000 microlitros y puntas azules.
• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Tapones para tubos de ensayo.
• Cubetas de espectrofotometría.
• Papel para limpiar las paredes de las cubetas antes de medir la absorbancia en el espectrofotómetro.

REACTIVOS

• R1: Tampón [GOOD pH 7,5 (50 mmol/L) y p-Clorofenol (2 mmol/L)].
• R2: Enzimas [Lipoprotein lipasa (LPL) (150000 U/L), Glicerol quinasa (GK) (500 U/L), Glicerol-3-oxidasa (GPO) (2500 U/L), Peroxidasa (POD) (440 U/L), 4-Aminofenazona (4-AF) (0,1 mmol/L) y ATP (0,1 mmol/L)].
• TRIGLICERIDOS CAL: Patrón primario acuoso de Triglicéridos (200 mg/dL).

MUESTRA

• Suero y plasma heparinizado.

PROCEDIMIENTO
Antes de comenzar con el proceso de la práctica, procederemos a realizar la preparación del reactivo de trabajo (RT). Para ello, disolveremos el contenido de un vial de R2 Enzimas en un frasco de R1 Tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.

1. En primer lugar, encender el espectrofotómetro y ajustarlo a las condiciones adecuadas.
2. Rotular 3 tubos de ensayo como "Blanco", "Patrón" y "Muestra", posteriormente pipetear:
1. 1 mL (=1000 microlitros) de reactivo de trabajo (RT) en cada uno de los 3 tubos de ensayo.
   
2. 10 microlitros de Patrón (TRIGLICERIDOS CAL) en el tubo de ensayo rotulado como "Patrón".
   
   
   
   
3. 10 microlitros de suero heparinizado en el tubo de ensayo con el nombre de "Muestra".
   

3. Tapar los tubos con tapones de la medida de éstos, mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC en el baño María.

4. Ajustar el espectrofotómetro a 505 nm. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.

CÁLCULOS
(A) Muestra: (A)Patrón x 200 (Conc. Patrón) = mg/dL de triglicéridos en la muestra.

RESULTADOS
- Absorbancia de la Muestra: 0'156 A.
- Absorbancia del Patrón: 0'313 A.
(0'156/0'313) x 200 = 99'68 mg/dL de triglicéridos en la muestra.
El resultado se encuentra dentro de los valores normales de triglicéridos.

VALORES DE REFERENCIA
Hombres: 40-160 mg/dL
Mujeres: 35-135 mg/dL

INTERFERENCIAS
No se han observado interferencias con bilirrubina hasta 170 micromol/L y hemoglobin hasta 10 g/L.
Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren en la determinación de los triglicéridos.

OBSERVACIONES

• TRIGLYCERIDES CAL: Debido a la naturaleza del producto, es aconsejable tratarlo con sumo cuidado ya que se puede contaminar con facilidad.
• La calibración con el Patrón acuoso puede dar lugar a errores sistemáticos en métodos automáticos. En este caso, se recomienda utilizar calibradores séricos.
• Usar puntas de pipeta desechables limpias para su dispensación.
• Estabilidad del RT: 6 semanas en nevera (2-8ºC) o una semana a 15-25ºC.
• Estabilidad de la muestra: 5 días a 2-8ºC.