6ª PRÁCTICA

08/01/2020
PRÁCTICA Nº6: "DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE COLESTEROL"

OBJETIVO

• Determinar la concentración de colesterol presente en la muestra del paciente por espectrofotometría.

UTILIDAD CLÍNICA
El colesterol es una sustancia grasa presente en todas las células del organismo. El hígado produce naturalmente todo el colesterol que necesita para formar las membranas celulares y producir ciertas hormonas. La determinación del colesterol es una de las herramientas más importantes para el diagnóstico y clasificación de las lipemias. El aumento del nivel de colesterol es uno de los principales factores de riesgo cardiovascular.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

FUNDAMENTO
El colesterol presente en la muestra origina un compuesto coloreado según la reacción siguiente:
Ésteres colesterol +  H2O ------> Colesterol + Ácidos grasos
                                          CHE
Colesterol + O2 -------> 4-Colestenona + H2O2
                          CHOD
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona --------> Quinonimina + 4 H2O
                                                             POD
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de colesterol presente en la muestra ensayada.

APARATAJE

• Espectrofotómetro
• Baño María.

MATERIALES

• Tubos de ensayo de plástico.
• Rotulador permanente.
• Gradilla.
• Pipeta automática de 100-1000 microlitros y puntas azules.
• Pipeta automática de 10-100 microlitros y puntas amarillas.
• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Tapones azules a medida de los tubos de ensayo.
• Cubetas de espectrofotometría.
• Papel para limpiar las paredes de las cubetas antes de medir la absorbancia en el espectrofotómetro. 
  

REACTIVOS

• R1: Tampón [PIPES pH 6,9 (90 mmol/L) y Fenol (26 mmol/L)].
• R2: Enzimas [Colesterol esterasa (CHE)(300 U/L), Colesterol oxidasa (CHOD) (300 U/L), Peroxidasa (POD) (1250 U/L) y 4- Aminofenazona (4-AF) (0,4 mmol/L)].
• CHOLESTEROL CAL: Patrón primario acuoso de Colesterol 200 mg/dL. Contiene Triton X-114 10-15%.

MUESTRA

• Suero.

PROCEDIMIENTO
Antes de iniciar la práctica, procederemos a la preparación del reactivo de trabajo (RT), para ello, disolveremos el contenido de un vial de R2 Enzimas en 1 frasco de R1 Tampón. Tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.

1. En primer lugar, encender el espectrofotómetro y ajustarlo a las condiciones adecuadas.
2. Rotular 3 tubos de ensayo y rotularlos como "Blanco", "Patrón" y "Muestra", una vez rotulados, pipetear:
1. 1 mL (=1000 microlitros) del reactivo de trabajo en cada uno de los 3 tubos.
   
   
   
   
   
   
   
2. Depositar 10 microlitros del patrón (CHOLESTEROL CAL) en el tubo rotulado como "Patrón".
   
3. Echar 10 microlitros de suero del paciente en el tubo de ensayo rotulado como "Muestra".
   
   
   
   
   
   
   

3. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC en el baño María.

4. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mínimo 60 minutos. Medir en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 505 nm.

CÁLCULOS
(A) Muestra: (A) Patrón x 200 (Conc. Patrón) = mg/dL de colesterol en la muestra.

RESULTADO
- Absorbancia del Patrón: 0'321 A.
- Absorbancia de la Muestra: 0'336 A.
(0'336: 0'321) x 200 = 209'35 mg/dL de colesterol en la muestra.
El resultado ha salido un poco elevado del valor normal, situándose en niveles muy bajos dentro del rango del nivel de colesterol moderado.

VALORES DE REFERENCIA
- Menos de 200 mg/dL: Normal.
- 200-239 mg/dL: Moderado.
- Mayor o igual a 240 mg/dL: Alto.

INTERFERENCIAS
No se han observado interferencias de hemoglobina hasta 5 g/L y bilirrubina hasta 10 mg/dL.
Se han descrito varias drogas y otras substancias que interfieren en la determinación del colesterol.

OBSERVACIONES

• CHOLESTEROL CAL: Debido a la naturaleza del producto, es aconsejable tratarlo con sumo cuidado ya que se puede contaminar con facilidad.
• La calibración con el Patrón acuoso puede dar lugar a errores sistemáticos en métodos automáticos. En este caso, se recomienda utilizar calibradores séricos.
• Usar puntas de pipeta desechables limpias para su dispensación.
• SPINREACT dispone de instrucciones detalladas para la aplicación de este reactivo en distintos analizadores.
• El suero es estable 7 días a 2-8ºC y 3 meses si se mantiene la muestra congelada (-20ºC).