3ª PRÁCTICA

04/12/19
PRÁCTICA Nº3: "INMUNODIFUSIÓN RADIAL"

OBJETIVO
Aprender a determinar cuantitativamente una concentración desconocida de un antígeno.

UTILIDAD CLÍNICA
La inmunodifusión radial (RID) es una técnica cuantitativa sensible que se usa a menudo clínicamente para detectar niveles de proteínas sanguíneas en pacientes.

FUNDAMENTO
La reacción fundamental de la inmunología implica la interacción de anticuerpos (Ab) y antígenos (Ag). Estas interacciones son útiles en la defensa del cuerpo contra infecciones bacterianas y virales y toxinas. Las capacidades de defensa dependen del reconocimiento de antígenos por componentes humorales del sistema inmunológico. A continuación, se producen anticuerpos específicos en respuesta a la exposición al antígeno.
La formación de complejos antígeno-anticuerpo es el primer paso para eliminar agentes infecciosos del cuerpo. Debido a que cada anticuerpo puede unirse a más de un antígeno y cada antígeno puede estar unido por más de una molécula de anticuerpo, pueden formarse complejos macromoleculares muy grandes. Estos complejos forman precipitados que pueden ser eliminados del cuerpo a través de diversos medios.
Cuando los anticuerpos y antígenos se insertan en diferentes áreas de un gel de agarosa, se difunden entre sí y forman bandas opacas de precipitado en la interfaz de sus frentes de difusión. Las reacciones de precipitación de anticuerpos y antígenos en geles de agarosa proporcionan un método de análisis de las diversas reacciones anticuerpo-antígeno en un sistema.  
El anticuerpo se incorpora en agarosa fundida que se vierte en una placa de Petri y se deja solidificar. Se cortan pequeños pocillos en la agarosa y se llenan con concentraciones conocidas de antígeno que interacciona con el anticuerpo presente en la agarosa. Se colocan muestras de concentraciones desconocidas en pocillos similares. Los antígenos en solución difunden entonces hacia fuera desde el pocillo en un patrón circular que rodea al pozo. El anticuerpo está presente en exceso y la difusión del antígeno continuará hasta que se forme un anillo estable de antígeno-anticuerpo. Hay complejos antígeno-anticuerpo en toda la zona que rodea el pocillo dentro de la línea de precipitación. En la línea de precipitación es donde se puede encontrar el mayor número de complejos porque el antígeno y el anticuerpo están presentes en proporciones aproximadamente iguales. Esto se conoce como la zona de equivalencia o el punto de equivalencia. Generalmente, es necesario de 24 a 48 horas para que ocurra la difusión óptima y aparezca la precipitación.
Para cada antígeno, se formará un anillo de precipitación de punto final de cierto diámetro. A partir de las concentraciones patrón conocidas, se puede trazar una curva patrón trazando la concentración de antígeno frente a las medidas cuadráticas de diámetro de los anillos. A partir de esta curva de calibración lineal se puede determinar la concentración de las muestras de antígeno desconocidas.

APARATAJE

• Microondas.
• Para conseguir que la solución llegue a punto de ebullición (sin dejarla hervir) para disolver la agarosa.
• Baño María.
• Enfriar la solución de agarosa a 50ºC y mantenerla caliente para que no se solidifique prematuramente y así evitar que la solución de anticuerpos se degrade al añadirlos a ésta.
• Estufa de incubación.
• Situar la cámara húmeda dentro de ésta a 37ºC y así acelerar la formación de arcos de precipitación.

MATERIALES

• Agua destilada.
• Matraz Erlenmeyer de 300 mL.
• Pipetas Pasteur.
• Varilla de vidrio agitadora.
• Papel Parafilm.
• Pipetas graduadas de 20 mL y de 10 mL con auxiliar de pipeteado verde y rojo.
• Vaso de precipitados de 100 mL.
• Pipeta manual de 5 mL y auxiliar de pipeteado azul.
• Tubos eppendorf.
• Rotulador permanente.
• Pipetas automáticas de 10-100 microlitros (puntas amarillas) y de 100-1000 microlitros (puntas azules).
• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Tijeras.
• Placas de Petri.
• Aguja.
• Pipeta automática de 5 microlitros (puntas amarillas).
• Cubetas de electroforesis.
• Toallas húmedas.
• Regla.
• Contador de colonias (luz).
• Papel de aluminio.
• Plantilla de papel para la realización de los pocillos.

REACTIVOS

• Sobre Tampón en polvo "Componente D" (buffer).
• Sobre "Componente C" (Agarosa).
• Solución de Antígeno Desconocida (Componente E).
• Solución de Antígeno Estándar (Componente B).
• Solución de anticuerpos (Componente A).

PROCEDIMIENTO

1) PREPARACIÓN TAMPÓN

1. Depositar una pequeña cantidad de agua destilada en un matraz Erlenmeyer de 300 ml.
2. Depositar el sobre del Tampón en polvo "componente D" (buffer).
   
   
3. Depositar agua destilada y enrasar con pipeta Pasteur en los 200 mL.
4. Agitar la disolución con una varilla de vidrio hasta que el polvo esté totalmente disuelto.
   
5. Separar y guardar 50 mL del tampón preparado.

2) PREPARACIÓN PLACAS DE AGAROSA

1. Añadir el contenido completo del paquete de agarosa (componente C) al matraz Erlenmeyer que contiene los 150 mL del Tampón previamente preparado.
   
2. Agitar vigorosamente la solución para dispensar los grumos.
3. Tapar la boca del matraz Erlenmeyer con papel Parafilm.
4. Introducir el matraz con la disolución en el microondas durante 1 minuto.
   
5. Una vez transcurrido este tiempo, agitar la mezcla del matraz con unas manoplas (para no quemarnos)  y volver a calentarla a intervalos de 25 segundos aproximadamente hasta que la agarosa esté totalmente disuelta. La solución final debe ser clara y transparente.
   
   
   Nota: La solución debe llegar a punto de ebullición (pero sin dejarla hervir) para disolver la agarosa.
6. Enfriar la solución de agarosa a 50ºC en el baño María.
   
   
   
   
7. Verter 26 mL de solución de agarosa fundida en un vaso de precipitados de 100 mL con ayuda de una pipeta graduada de 20 mL y otra de 10 mL con el auxiliar de pipeteado rojo y verde.
8. Añadir el contenido completo de la Solución de anticuerpos (Componente A) a la solución de agarosa caliente de 26 mL.
9. Mezclar la solución.
   Nota: Mantener la disolución desde que la pusimos en el baño María a 50ºC en éste, para mantener la solución caliente y evitar que se solidifique prematuramente.
10. Con una pipeta manual de 5 mL, dispensar 3 mL en el fondo de cada placa de Petri, extender suavemente la agarosa para cubrir el fondo. Dejar que la agarosa se solidifique.

3) PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS (PATRONES Y MUESTRA PROBLEMA)
Se deben preparar diluciones seriadas de la Solución de Antígeno Estándar (Componente B) para construir la curva estándar. Para ello, cada grupo de alumnos deberá:

1. Rotular 3 tubos:
1. Marcar un tubo eppendorf como "E" (Estándar).
2. Marcar otro tubo eppendorf como "D" (Desconocido).
3. Marcar otro tubo eppendorf como "T" (Tampón). 

2. Alicuotar 75 microlitros de Solución de Antígeno Estándar (Componente B) en el tubo  eppendorf previamente rotulado como "E". Usaremos la pipeta automática de 10-100 microlitros y puntas amarillas. 

3. Alicuotar 10 microlitros de Solución de Antígeno Desconocida (Componente E) en el tubo eppendorf previamente rotulado como "D". Usaremos la pipeta automática de 10-100 microlitros.

4. Alicuotar 1 mL (= 1000 microlitros) de Tampón (guardado de la etapa de preparación de agarosa del apartado) en el tubo eppendorf rotulado como "T". Usar la pipeta automática de 100-1000 microlitros y puntas azules.

PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES ESTÁNDAR (BATERÍA DILUCIÓN)

1. Rotular 4 tubos eppendorf: 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16.
   
2. Utilizar una pipeta automática de 10-100 microlitros y añadir 50 microlitros de Tampón a cada uno de los 4 tubos.
3. Con una punta de pipeta nueva, añadir 50 microlitros del tubo "E" al tubo etiquetado como 1:2. Mezclar. Desechar la punta de pipeta al contenedor de desechos.
4. Con una punta de pipeta nueva, transferir 50 microlitros de la dilución 1:2 al tubo etiquetado 1:4. Mezclar. Desechar la punta.
5. Con una punta nueva de pipeta, transferir 50 microlitros de la dilución 1:4 al tubo marcado con 1:8. Mezclar. Desechar la punta.
   
6. Con una punta de pipeta nueva, transferir 50 microlitros de la dilución 1:8 al tubo marcado con 1:16. Mezcla. Desechar la punta de pipeta.
7. Ahora hay 5 muestras de antígeno para la curva estándar:
   

4) PREPARACIÓN DE LOS POCILLOS EN LAS PLACAS DE AGAROSA

1. Colocar la plantilla debajo de la placa para que el patrón esté centrado.
   
2. Realizar los pocillos, para ello:
1. Recortar una pipeta Pasteur por la parte inferior a la medida de los pocillos de la plantilla con ayuda de unas tijeras.
2. Presionar la boquilla de la parte superior de la pipeta.
3. Hincarla en el pocillo que queremos realizar.
   
   
   
   
4. Soltar la boquilla de la pipeta. De esta manera, la pipeta Pasteur succionará el tapón de agarosa.
   
   
   Nota: En el caso de que el tapón de agarosa quede adherido por una parte todavía al gel, nos ayudaremos de una aguja.
   

5) CARGA DE LOS PATRONES Y LA MUESTRA

1. En la parte inferior de la placa, numerar los pocillos en el perímetro de la placa del 1 al 5. Dejar el pocillo del centro sin marcar (sin número).
2. Cargar los pocillos del 1 al 5 con la misma micropipeta. En el pocillo nº5, cargar 5 microlitros de la dilución de antígeno 1:16. Asegurarse de que la muestra cubre toda la superficie del pocillo extendiéndola cuidadosamente con la punta de la pipeta.
3. En el pocillo nº4, cargar 5 microlitros de la dilución de antígeno 1:8.
4. En el pocillo nº3, cargar 5 microlitros de la dilución de antígeno 1:4.
5. En el pocillo nº2, cargar 5 microlitros de la dilución de antígeno 1:2.
6. En el pocillo nº1, cargar 5 microlitros del antígeno no diluido.
7. Con una punta de micropipeta nueva, cargar 5 microlitros de la solución de proteína de concentración desconocida en el pocillo central.
8. Marcar la cubierta de la placa de Petri con las iniciales de los componentes del grupo.
9. Colocar la tapa sobre la placa, colocar la placa hacia arriba (no invertir) dentro de la cámara de incubación sobre las toallas de papel húmedas.
10. Cubrir la cámara húmeda y colocarla en una estufa de incubación a 37ºC o a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas.
    Nota: Los compañeros que terminaron antes de cargar los pocillos junto con los maestros, prepararon la cámara de incubación mientras los demás terminábamos. El procedimiento de la preparación de la cámara de incubación es el siguiente:
1.  Extender en la parte inferior de una cubeta varias toallas de papel.
2. Agregar agua destilada a las toallas hasta saturarlas de agua. Todo el líquido debe ser absorbido por las toallas.
3. Cubrir la cubeta una vez depositadas las placas de cada grupo de alumnos con papel de aluminio.
      

RESULTADOS
Los anillos de precipitina serán visibles en 48 a 72 horas. 

Con ayuda de una regla y de la luz del contador de colonias, medir el diámetro (a partir de los centros de los pocillos) del anillo de precipitación en milímetros.

Para trazar la curva estándar, elevar al cuadrado el valor del diámetro, para realizar la gráfica indicar la concentración del antígeno en el eje X y el diámetro al cuadrado en el eje Y. Dibujar la línea que mejor se ajuste entre estos puntos. 

 
A partir de la curva estándar realizada en "Excel", se puede determinar la concentración desconocida encontrando el valor del cuadrado del diámetro en el eje Y, encontrando el punto de intersección en la línea de la curva estándar y obteniendo el valor en el eje X. El valor en el eje X es la concentración de antígeno en la solución.

  

HALO	Concentración
400	2
225	1
144	0.64
121	0.5
81	0.25
36	0.125
0	0

Por lo que la muestra problema tiene una concentración de 0'64 mg/ml.

OBSERVACIONES 

• Almacenar los componentes a las temperaturas indicadas en el protocolo.
• Asegurarse de que el material de vidrio esté limpio, seco y libre de residuos de jabón.
• Se necesitan aproximadamente 30 minutos para la preparación de las placas (generalmente se requieren 10 minutos de este tiempo para la solidificación).
• En la preparación de la agarosa, si se ha producido una evaporación de solución detectable tras haberla introducido en el microondas, agregar agua destilada caliente para ajustar el volumen de solución hasta nivel original marcado en el matraz Erlenmeyer. No usar agua fría o la solución de agarosa puede enfriarse demasiado rápido y solidificarse de forma prematura.
• Antes de añadir la Solución de anticuerpos (Componente A), asegurarse que la temperatura de la solución de agarosa se encuentra a 50ºC, para evitar la degradación de los mismos.
• Una vez solidificada la agarosa en las placas de Petri (antes de realizar los pocillos), si las placas no se van a utilizar el día de la preparación, se pueden envolver con film transparente de plástico y almacenar en la nevera durante no más de una semana.
• Se pueden alicuotar las soluciones antes del día de la práctica, en ese caso se deberán guardar a 4-8ºC hasta el día de la práctica.
• Evitar sobrellenar los pocillos al añadir las muestras a éstos.
• No inclinar o invertir las placas de Petri al transferirlas a la cámara de incubación.
• La colocación de la cámara de incubación en un horno de incubación a 37ºC acelerará la formación de arcos de precipitación.