1ª PRÁCTICA

27/11/19
PRÁCTICA Nº1: "IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS EN SUERO"

OBJETIVOS

• El objetivo de esta práctica, es la separación mediante electroforesis de proteínas presentes en suero.
• Conocer el funcionamiento del fotodensitómetro.

UTILIDAD CLÍNICA
Las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos corporales (plasma, orina...).
Las proteínas circulantes se sintetizan principalmente en el hígado.
La concentración de las proteínas en suero es de 6.6 a 8.7 g/dl.
En caso de enfermedad, tanto la concentración total como la de las distintas fracciones pueden verse alteradas.
La proporción de las fracciones proteicas individuales cambia en el transcurso de un gran número de enfermedades lo que conlleva que, la cuantificación de las mismas sea de valor considerable en el diagnóstico clínico.
En cuanto a la patología de las proteínas consideradas de manera fraccionada o individual, distinguiremos aquellas situaciones en las que aumenta o disminuye una fracción concreta (disproteinemias) y, aquellas otras en las que aparece una proteína o fracción anormal (paraproteinemias) 

FUNDAMENTO
Las proteínas, moléculas anfóteras, en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.
Si una disolución de proteínas se coloca en un medio alcalino (pH=8’6), las proteínas adquieren carga negativa (mayor en la albúmina, con pI 4’6, y menor en las Gamma-globulinas, con pI 7’2), por lo que se desplazarán del polo negativo al positivo de un campo eléctrico. La albúmina recorrerá mayor distancia que las alfa, beta y gamma-globulinas cuando apliquemos un campo eléctrico a una tira con la solución proteica. 
Como consecuencia de esta migración, se obtienen habitualmente cinco fracciones correspondientes a diferentes proteínas plasmáticas con carga negativa decreciente:

- Albúmina (la más negativa).
- Alfa₁-globulinas.
- Alfa₂-globulinas.
- Beta-globulinas.
- Gamma-globulinas (las menos negativas).


APARATAJE

• Alimentador de electroforesis: G-201, SERIE B.

Su función es aportar energía eléctrica de corriente continua con unas condiciones de voltaje o de intensidad constantes. La mayoría de las electroforesis se hacen a voltaje constante (200 voltios, en el caso de proteinogramas). 

• Fotodensitómetro: fotodensitómetro automático atom 428 b, digiscan.

Basado en medidas fotométricas; en el fotodensitómetro se selecciona una longitud de onda adecuada al colorante utilizado y posteriormente se hace pasar un haz de luz a través de la lámina; este haz luminoso irá encontrándose con las distintas manchas, que absorberán más o menos luz, y llegará a un detector que registrará la luz transmitida y la representará en un gráfico en forma de picos denominado CROMATOGRAMA.

• Estufa.

Para conseguir la temperatura adecuada para el calentamiento de la tira.

MATERIALES

• Cubeta de electroforesis.
• Aplicador LRE Medizintechnik.
• Tiras de acetato de celulosa almacenadas en un bote con metanol 40%.
• Láminas Mylar.
• Papel absorbente.
• Pinzas metálicas.
• Varilla de vidrio.
• Puente de electroforesis.
• Placa de vidrio.

REACTIVOS

• Solución tampón (Tris Hipurato).
• Colorante rojo Ponceau.
• Decolorante (1 sobre en polvo de ácido cítrico diluido en 1 L de agua destilada).
• Solución transparentadora.
• Solución disolvente (ácido acético al 80%).

MUESTRA
Suero fresco.

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar, coger una tira de acetato de celulosa por cada grupo de alumnos con unas pinzas metálicas. Estas tiras se encuentran conservadas en un envase con una solución de metanol al 40%.
   
   
2. Depositar la tira y sumergirla en una cubeta previamente llenada con la solución tampón Tris Hipurato (pH 8.8) listo para su uso y recuperado de otra práctica realizada anteriormente.
   
   
   
   
   
   
   Nota: aunque la solución tampón Tris Hipurato ya venía preparada, sabemos que es una disolución formada por 100 ml de Tris Hipurato concentrado en 1000 ml de agua destilada.
3. Esperar unos 10 o 15 minutos.
4. Mientras tanto, procederemos a la preparación de la cámara de electroforesis. Para ello, llenaremos completamente un compartimento de la cámara de electroforesis con el Tampón (usado) y posteriormente inclinaremos la cámara para igualar el nivel en ambos compartimentos. 
   
   
   
   
    
5. Una vez hecho esto, colocar las tiras impregnadas de buffer entre dos hojas de papel absorbente para retirar el exceso de tampón. 
   
6. A continuación, cogeremos la tira de acetato de celulosa con las pinzas y la situaremos sobre el puente, de manera que la cara absorbente de la tira, quede hacia arriba (el borde cuadrado debe estar en la esquina inferior derecha).
   Nota: El puente se prepara de la siguiente forma: en primer lugar, bajar las alas del puente situadas a los laterales de éste, situar la tira sobre el puente y colocar en ambos lados los topes.
   
   
   
   
   
   
7. Situar el puente con la tira de acetato de celulosa sobre la cubeta de electroforesis previamente llenada con el tampón.
   
   
8.  Aplicar la muestra de suero fresco en la tira, utilizando un aplicador. Para ello, debemos pulsar el botón que presenta el dispositivo, lavarlo con agua destilada, secarlo con papel, coger la muestra de suero y aplicarla en el extremo de la tira que quede situado más cerca del polo negativo. La aplicación debe hacerse a 2 cm del borde. Tapar la cámara de electroforesis.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
   
9. Conectar la fuente de alimentación a 200 V durante 35 minutos. Durante este tiempo, preparar las cubetas con el colorante, decolorante y transparentador que vamos a utilizar una vez vez realizada la electroforesis.
   
   
   
   
10. Una vez transcurrido el tiempo, desconectar la fuente de alimentación, extraer las tiras de los puentes con las pinzas y situarlas en la cubeta que contiene el colorante ("Rojo Ponceau"). Debemos dejarlas sumergidas durante 5 minutos. Mientras tanto, agitar suavemente la cubeta con las manos, simulando un agitador rotativo.
    
    
    
    
    
    
    
11. Después de sumergir las tiras en el colorante, las traspasaremos a la cubeta que contiene el decolorante. Aplicar 3 o 4 baños sucesivos hasta obtener un fondo blanco con la solución de lavado. Dejarlas sumergidas en el decolorante durante unos minutos.
    
    
    
    
    
    Nota: Para preparar el decolorante, hay que disolver un sobre de ácido cítrico en polvo en 1 litro de agua destilada.
    
    
    
    
12. Al finalizar el proceso de decoloración, sumergir las tiras en el líquido transparentador durante 1 minuto. 
    
    
    
    
    
    
    
13. Posteriormente, colocar cada tira sobre la superficie de un trozo de Mylar film recortado a su medida y eliminar el exceso de líquido transparentador con una varilla de vidrio.
    
    
    
    
    
    Nota:Todo esto se ha realizado sobre una placa de vidrio, para poner todas las tiras de acetato de celulosa de cada grupo juntas.
14. Introducir la placa de vidrio con todas las tiras en la estufa a 80ºC durante 10 minutos. Sacar la placa de vidrio de la estufa y esperar a que alcance la temperatura ambiente. Una vez transcurrido dicho tiempo la tira quedará transparente, salvo las diferentes fracciones proteicas.
    
    
    Nota: Como no ha habido tiempo suficiente, hemos dejado la lectura de los resultados para el próximo día de clase.

28/11/19
RESULTADOS
El resultado de la electroforesis es la aparición de una serie de bandas correspondientes a cada una de las fracciones proteicas; dichas bandas se leen en un fotodensitómetro y son transformadas en un gráfico en el que aparece un pico por cada banda (la altura del pico se corresponde con la densidad de la banda y su anchura con la anchura de la banda).
Cuantificación por fotodensitometría: tras el transparentado, introducir la tira en un fotodensitómetro y proceder al trazado del proteinograma y a su cuantificación por fracciones.
Para ello, recortaremos las tiras y las medimos mediante el fotodensitómetro. 

Este aparato dará un valor total (el área bajo pico), correspondiente al total de proteínas.
Después cada pico, correspondiente a cada fracción proteica, nos dará un nuevo valor.
Cálculos: Ahora dividimos el resultado que nos ha salido en cada pico entre el valor total y obtenemos el porcentaje de cada fracción en la muestra. Es decir, sumando las absorbancias (A) de cada fracción, obtendremos una cifra que corresponderá al 100% de proteínas. Una vez hecho esto, dividiremos la absorbancia de cada fracción entre el total de la absorbancia y lo multiplicaremos por 100, de esta manera, obtendremos el porcentaje de cada fracción.
Los resultados de 2 de los picos obtenidos en el dibujo han sido los siguientes:

El dibujo proporcionado por el fotodensitómetro es el siguiente:

Nota: El primer pico que aparece a la derecha, no debería haber aparecido, ya que se corresponde con algún error del fotodensitómetro a la hora de leer las bandas proteicas.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

OBSERVACIONES

• Evitar utilizar plasma como muestra porque el fibrinógeno puede crear errores de interpretación en la zona de las gammaglobulinas.
• Las tiras se decoloran más rápidamente utilizando un agitador rotativo.
• La lectura también se puede realizar mediante cuantificación por elución: una vez realizada la decoloración, preparar 6 tubos marcados (blanco, albúmina, alfa1, alfa2, beta y gamma). En cada uno de los tubos de ensayo pipetear 3 ml de la solución disolvente. Cortar las distintas fracciones y colocarlas en el tubo correspondiente hasta su perfecta disolución.
• Leer las distintas fracciones frente al blanco a 520-530 nm (rojo Ponceau).
• Como decolorante, se puede utilizar cualquier ácido débil diluido, cítrico o acético al 5%.
• Hay que tener en cuenta que los hilos de platino se rompen con frecuencia.
• El colorante rojo Ponceau se usa para proteinogramas.