5ª PRÁCTICA

18/12/19
PRÁCTICA Nº5: "INMUNODOTTING PARA HEPATITIS AUTOINMUNES"

UTILIDAD CLÍNICA
Alphadia Liver Profile Dot es un kit de inmunodoting destinado a la detección en suero humano de auto-Ac tipo IgG/IgM antimitocondriales dirigidos contra los siguientes Ag: M2/PDC nativo (subunidades E1, E2 y E3 del complejo Piruvato Deshidrogenasa) y M2 recombinante (mezcla de las subunidades E2 del complejo Oxoglutarato Deshidrogenasa, de la cadena ramificada del complejo Deshidrogenasa Ácida y del complejo Piruvato Deshidrogenasa).
 
FUNDAMENTO
La prueba se basa en el principio del Enzimoinmunoanálisis. Cada tira del test está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico; en dicha membrana se han dispensado directamente los distintos Ag anteriormente mencionados. Durante el desarrollo de la prueba, las tiras se incuban con suero diluido de los pacientes. Si dichos sueros contienen los auto-Ac buscados, se unirán específicamente al correspondiente Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP; dicho conjugado va dirigido contra la Ig G humana. El conjugado se une a los complejos Ag-Ac. Después de realizar un segundo lavado con el fin de eliminar el exceso de conjugado, se añade el sustrato que, por acción de la enzima ALP, desarrollará una coloración púrpura en el lugar correspondiente de la membrana. Dicha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.

APARATAJE

• Agitador

MATERIALES

• Tiras dot.
• Bandejas de incubación.
• Pipeta automática de 1000-5000 microlitros (puntas de 5000 microlitros).
• Papel absorbente.
• Pipeta automática de 10 microlitros y puntas amarillas.
• Pipetas Pasteur.
• Bote de orina ("contenedor de desechos"). 
  

REACTIVOS
1) Para ser diluido:

• Tampón de lavado concentrado 10x (1x40 mL): Tapón incoloro.

2) Listo para usar:

• Tampón de dilución (1x40 mL): Tapón amarillo.
• Conjugado (1x40 mL): Tapón rojo.
• Sustrato (1x40 mL): Bote marrón.
  Nota:Reacciona con el enzima produciendo un cambio de color.

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar, realizamos la dilución del tampón de lavado. 
   
   
   
   
   
   Nota: De este paso del procedimiento, se han encargado los alumnos de la primera fila de la clase, y una vez realizada la dilución, han hecho alícuotas para cada mesa de alumnos.
2. Colocar una tira por paciente en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba.
   Nota: En mi grupo, hemos colocado 2 tiras en la bandeja de incubación (cada una en un canal distinto de ésta).
3. Añadir 2 mL (=2000 microlitros) de tampón de lavado en cada canal usado (2 canales).
   
   
   
   
4. Incubar 10 minutos en agitación a 120 r.p.m. Tras una correcta incubación, los puntos azules de la tira desaparecen por completo; si no es así, continuar con el procedimiento hasta que lo hagan.
   
5. Eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja (realizar este procedimiento en el fregadero del laboratorio). Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.
   
   
   
   
6. Añadir 1'5 mL de tampón de dilución en cada uno de los dos canales utilizados.
   
   
   
   
   
   
   
   
7. Añadir 10 microlitros de muestra del paciente por canal.
   Nota: Se debe evitar tocar la membrana con las puntas de las pipetas. La muestra se debe dispensar sobre la parte superior de la tira (zona de la etiqueta de plástico).
   
   
   
   
   
   
   
8. Incubar 30 minutos en agitación a 120 r.p.m.
   
9. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja sobre el fregadero. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente. 
   
   
   
   
10. Lavar 2 veces cada uno de los dos canales utilizados (durante 3 minutos cada vez) con 1'5 mL de tampón de lavado. Agitar durante el lavado. Después del primer lavado, eliminar el líquido invirtiendo la bandeja de incubación sobre el fregadero. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.
    
11. Tras el 2º lavado, eliminar el líquido con ayuda de una pipeta Pasteur.
    
12. Añadir 1'5 mL de conjugado por canal utilizado. Incubar 20 minutos en agitación. 
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
13. Eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente. 
14. Lavar 2 veces cada uno de los dos canales utilizados (durante 3 minutos cada vez) con 1'5 mL de tampón de lavado. Agitar durante el lavado. Después de cada lavado, eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.
    
    
    
    
15. Añadir 1'5 mL de sustrato por canal utilizado. Incubar 10 minutos en agitación.
16. Eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja. Las tiras se adhieren al fondo de los canales. Secar el borde de la bandeja con papel absorbente.
17. Lavar una vez más (durante 3 minutos) con 1'5 mL de tampón de lavado para detener la reacción.
    
    
    
    
18. Extraer las tiras de los canales y dejarlas secar en papel absorbente.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

1. Despegamos la cubierta del adhesivo en la parte posterior de cada tira y colocamos dichas tiras con los puntos boca arriba junto a la hoja de interpretación proporcionada en el kit. Este indicará las posiciones respectivas de los diferentes controles y antígenos en la membrana.
2. El punto superior (control positivo) debe aparecer coloreado en todos los pacientes. Sólo un punto de control de reacción claramente positiva asegura que los resultados son válidos, que la prueba se desarrolló correctamente y/o los reactivos no se han degradado.
3. En condiciones óptimas, y si la muestra está libre de sustancias que interfieran, el control negativo (el punto inferior) será incoloro. La aparición de color en el punto de control negativo indica la existencia de uniones inespecíficas debidas a sustancias con capacidad de interferir y que están presentes en la muestra.
4. Comparamos el punto correspondiente a cada antígeno específico con el punto de control negativo.

• Resultado positivo: Una muestra es positiva para un anticuerpo específico si la intensidad de color del punto correspondiente a su Ag es mayor que la intensidad de color del control negativo.
• Resultado negativo: Una muestra es negativa para un anticuerpo específico si la intensidad de color del punto correspondiente a su Ag es menor o igual que la intensidad de color del control negativo. 
  
  
  
  
      

El resultado ha sido positivo. 

OBSERVACIONES

• Para la realización de esta práctica se requiere bastante tiempo (3 h.) y por ello, debemos estar atentos al tiempo que transcurre para no pasarnos de los minutos requeridos en cada paso del procedimiento y debemos intentar ser precisos y muy cuidadosos a la hora de pipetear las cantidades de los reactivos tantas veces como nos indica el protocolo.