4ª PRÁCTICA

12/12/19
PRÁCTICA Nº4: "HEMOGLOBINA GLICOSILADA EN COLUMNA"

OBJETIVO

• Determinación cromatográfica-espectrofotométrica de la Hb A1c en sangre.

 UTILIDAD CLÍNICA

• Determinación cuantitativa in vitro de la hemoglobina A1c en sangre.
• La prueba de hemoglobina glicosilada (HbA1c) es un examen de sangre para la diabetes tipo 2 y prediabetes. Mide el nivel promedio de glucosa o azúcar en la sangre durante los últimos tres meses. Los médicos pueden usar la prueba HbA1c sola o en combinación con otras pruebas de diabetes para hacer un diagnóstico. También utilizan la HbA1c para ver lo bien que está manejando su diabetes. Esta prueba es diferente a los controles de azúcar en la sangre que las personas con diabetes se hacen todos los días.
• Si usted tiene diabetes, debe someterse a la prueba HbA1c por lo menos dos veces al año.

FUNDAMENTO
Mezclando una alícouta de sangre completa con un agente hemolizante, se obtiene la lisis de los hematíes, la liberación de la hemoglobina contenida en ellos y la eliminación de la fracción lábil. La fracción A1c de la hemoglobina glicosilada es separada de la Hb A1A+B mediante cromatografía de intercambio catiónico.
El porcentaje de Hb A1c se obtiene por comparación de la absorbancia (a 415 nm) del eluído con la absorbancia de la hemoglobina total.
El procedimiento no requiere ninguna calibración y puede realizarse en un rango de temperaturas de 20 a 28ºC.

APARATAJE

• Espectofotómetro (GENESYS 10 uv):
• Utiliza una lámpara de xenón de alta intensidad y una geometría óptica de doble haz que permiten obtener una calidad de datos sin igual.
• Mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz ultravioleta y visible (200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del haz.
• Funcionamiento: Consiste básicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda.
• Principio de operación: Tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (de una longitud de onda particular) a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra.

MATERIALES

• Columnas cromatográficas.
• ESTABILIDAD: son estables a 15-30ºC hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Conservar en la oscuridad.
• Tubo ensayo de 3 mL.
• Tubo ensayo de plástico de 10 mL.
• 2 gradillas.
• Pipetas automáticas de 10-100 microlitros (puntas amarillas) y de 100-1000 microlitros (puntas azules).
  

REACTIVOS

• REACT.1: biftalato de potasio (1x20 ml).
• REACT.2: tampón 42 mmol/L, LiCl, pH 5.96 (1x80 ml).
• REACT.3: tampón 50 mmol/L, LiCl, pH 5.98 (1x80 ml).
• ESTABILIDAD: son estables a 15-30ºC hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.

MUESTRA
Sangre completa con EDTA u oxalato de flúor.
No usar heparina como anticoagulante.
La muestra es estable 7 días a 2-8ºC.

PROCEDIMIENTO
Longitud de onda: 415 nm.
Paso de luz: 1cm.
Lectura: frente a agua destilada.
Temperatura: 20-28ºC.
Método: Espectrofotométrico.

1) PREPARACIÓN DEL HEMOLIZADO

1. Pipetear en un tubo de ensayo de plástico de 3 mL, 0'050 ml (= 50 microlitros) de sangre anticoagulada con EDTA.
   
   
   
   
2. Posteriormente, depositar 0'450 ml (=450 microlitros) del reactivo 1.
   
   
   
   
3. Mezclar vigorosamente e incubar a Tª ambiente (20-25ºC) durante 10-15 minutos. 
   
   
   Nota: No usar el hemolizado pasadas 2 horas tras su preparación.

2) SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA

1. Quitar el tapón superior de la columna y romper la espita inferior. 
   
   
2. Retirar el líquido de la columna dejando reposar ésta en un tubo de ensayo.
   
3. Pipetear en el interior de la columna:
1. 50 microlitros del hemolizado previamente preparado.
   
   
   
   
   
   
   
2. Esperar 3 minutos y descartar el eventual eluído.
3. Posteriormente, depositar en el interior de la columna 2000 microlitros del reactivo 2 (previamente habíamos llenado un tubo de ensayo con el reactivo).
   
   
   
   
   
   
   
4. Descartar el eluído dejando reposar la columna en el tubo de ensayo.
   Nota: Todo este paso se realiza con la columna introducida en el tubo de ensayo de plástico.
5. Pipetear 2.0 ml del reactivo 3 y recoger el eluído (Hb A1c). 
   
   
   
   
   
   Nota: Los reactivos 2 y 3 los hemos depositado en dos tubos de ensayo de plástico para pasarle los botes de éstos a los compañeros que estaban esperando:
   
   
   
   
   
   
   
6. Mezclar el eluído obtenido.
7. Leer la absorbancia de la fracción A1c de la hemoglobina a 415 nm frente a agua destilada (A Hb A1c).

3) PREPARACIÓN DE LA HEMOGLOBINA TOTAL:

1. Pipetear en un tubo:
1. 100 microlitros del hemolizado.
2. 12 ml de agua destilada.
3. Mezclar la disolución.
   
4. Leer la absorbancia de la hemoglobina total (A Hb Total) a 415 nm frente a agua destilada.

CÁLCULOS
(A Hb A1c) / (3 x A Hb Total) x 100= % Hb A1c.

RESULTADO
Blanco frente a agua destilada a 415 nm:

Absorbancia de la hemoglobina en columna: 0'130 A.

Absorbancia de la hemoglobina Total: 0'994 A.

0'130 / (3 x 0'994) x 100= 4'36%.
El porcentaje de la hemoglobina glicosilada se encuentra dentro de los valores normales, por lo que el resultado de la práctica ha sido correcto.

VALORES DE REFERENCIA
Rango normal: 4,2-6,2 %.

OBSERVACIONES

• La hemoglobina total es más oscura porque contiene todos los tipos de hemoglobina y está 3 veces más diluida.
• Realizar un hemolizado por mesa de alumnos.
• Para cada columna se precisa de 2 tubos de ensayo de plástico.
• La preparación de la hemoglobina Total sólo lo han hecho 2 o 3 grupos para toda la clase. En nuestro grupo sólo hemos medido la Absorbancia.
• Usar columnas y reactivos del mismo lote.
• REACT.2 y REACT.3 contienen sustancias peligrosas.
• Desarrollar el test a una temperatura comprendida entre 20 y 28ºC, es decir, a temperatura ambiente.
• Reactivos y columnas deben atemperarse antes de su uso.
• Durante todo el proceso cromatográfico debe evitar  que la resina quede sin tampón por un tiempo superior a 5 minutos.